文献学习：利用光热红外显微成像技术探测土壤和沉积物中的矿物-有机微观互作

摘要

本篇文章实介绍了一种探测微米纳米尺度下土壤微生物-矿物-有机质间相互作用的显微技术，也就是光热红外显微成像技术(optical photothermal infrared microscopy, O-PTIR)，这个技术的优点在于可以较为灵敏地检测高结晶度的土壤矿物和低分子量有机质，特别是对于有机质，O-PTIR更是具备高降噪和高分辨率，可以在成分复杂的土壤中精确区分与矿物结合及没有与矿物结合的有机质状态。

研究背景

微生物、矿物、有机质是土壤系统的重要组成部分，它们间的相互作用显著影响着土壤系统的养分循环、污染物动态和碳储存。为解析这三者的相互作用机制，研究者可以借助高分辨率显微分析技术从微纳米层次开展分析。传统的傅里叶变换红外显微镜横向分辨率较低，不足以分辨有机-矿物微观结构，ATR模式的出现虽然提高了分辨率，但也会损伤样品。

故此，研究者提出使用O-PTIR技术，该技术可以通过测量样品的热膨胀和折射率的变化来提高分辨率，同时与样品间没有直接的物理接触，可以避免样品受损，此外，还可以实时观测样品形貌，方便研究者开展时间尺度的动态分析。

技术原理

O-PTIR采用双物镜技术以及红外、可见光双重辐照，其检测原理主要基于样品的热膨胀率和折射率。在红外激光聚焦于样品上后，样品部分区域吸收红外光导致升温，样品随之产生热胀冷缩，折射率也发生变化，在此期间，O-PTIR通过发射可见光并通过测量反射光强度变化测算样品膨胀率和折射率变化，检测到的膨胀率和折射率变化与样品吸附红外光的能力成正比，并取决于所测样品的体积和性质。通过这种技术，O-PTIR可以检测固体液体、水相油相等多种状态的物质，可以应用于热膨胀敏感型样品的测定。

实验目的

试验1

本研究涉及的试验从多个方面展开，首先是O-PTIR辐射损伤阈值评估，因为高功率的辐照可能造成样品损伤，首先将波数设置为吸收率最高的光谱带，然后缓慢提高红外/可见光激光功率，通过监测O-PTIR或DC信号波动来判断样品是否损伤。

图中显示了低分子(谷氨酰胺)和高分子(木质素)量有机化合物的损伤阈值评估结果。O-PTIR信号是可见光激光束的相对红外吸收，DC信号是可见激光束的直流电信号，与O-PTIR信号无关。图的上半部分是是红外光的损伤阈值评估，可以发现可见激光束的直流电信号DC值不发生变化，而O-PTIR红外信号随之发生波动，每个水平灰色阶梯表示一种激光功率，到了末期低分子量有机质的O-PTIR信号不再平整，说明样品表面性质发生了变化，可能产生了辐射损伤，而高分子量这边的先下降后持平，可能转化成了其他类型的物质。图的下半部分是可见光的损伤阈值评估，可以发现DC值发生了波动，O-PTIR信号是可见激光束的相对红外吸收，因此也随着可见光功率的变化而变化，激光功率超过阈值后，O-PTIR信号都陡然下跌，均可能产生辐射损伤。

辐射损伤阈值评估的结果可以用于试验参数的选取，略低于损伤阈值的功率通常为最佳试验参数，可以最大限度地提高O-PTIR检测效果而不造成样品损伤。

基于辐射损伤阈值评估方法，实验可以得出土壤和沉积物中常见矿物、有机化合物的最佳O-PTIR辐照参数。低结晶度矿物应使用较低功率的辐照，中间的图显示了辐照大于或小于损伤阈值时不同矿物O-PTIR峰图，可以发现超过阈值后矿物出现了重结晶现象。此外，与高分子量有机质相比，低分子量有机质通常表现出更高的损伤阈值，但亮氨酸例外。

试验2

本研究的第二个实验横向比较了O-PTIR, ATR-FTIR and μ-FTIR三种检测技术在鉴定土壤有机质-矿物微观互作方面的优劣。

在O-PTIR、μ-FTIR和ATR-FTIR分析的土壤中矿物、有机质谱图中，自上而下三条线依次为O-PTIR、μ-FTIR和ATR-FTIR，高结晶度如勃姆石，低结晶度如水铁矿，高分子量如胡敏酸，低分子量如谷氨酸、亮氨酸均有在图中出现，浅色区间指代的是标准偏差。

可以发现，O-PTIR和ATR-FTIR识别特征物的能力要明显高于μ-FTIR，对于胡敏酸和水铁矿，μ-FTIR的谱线基本持平很少出现波峰。蒙脱石和高岭石图中的右侧三峰各自代表Si−O−Si、Al−OH、O−H，O-PTIR峰图出现的较大标准偏差的原因可能是叶状硅酸盐的强各向异性，这说明O-PTIR可以用于区分不同取向的矿物。

此外，从信号强度也就是峰高来看，O-PTIR无疑是最占优势的，且对于亮氨酸这类小分子有机质，O-PTIR更是可以识别其他两种技术无法定位特征峰，比如波数1620cm^-1处的峰。

试验3

试剂准备：人为购买/配置/提取微生物、矿物、土壤有机质标准样品

合成有机-矿物微型复合体：①溶液法共沉淀氢氧化铝和谷氨酸；②将谷氨酸吸附到勃姆石上制备有机-矿物微型复合体

制片：

√ 固体样品：用压片机将样品粉末压成几毫米厚的薄片后放置在CaF₂窗口上

√ 液体样品：滴在CaF₂窗口上阴干

√ 根组织：直接放置在CaF₂窗口上

设备参数：

√ 模式：共传播

√ 扫描：28×28 μm²，步长2μm，扫描3次

√ 波数：红外3000-960cm⁻¹

√ 分辨率：光谱分辨率200 cm⁻¹·s⁻¹，红外波数分辨率2cm⁻¹

去除基线：最小强度的线性减法

归一化处理：取所有光谱950-1750cm−1区域的最高峰为E₀

数据处理：PTIR studio software version 4.5.1，Orange-based Quasar software version 3.35.0

本研究的第三个试验主要针对有机-矿物微型复合体，通过人为购买/配置/提取的手段准备微生物、矿物、土壤有机质标准样品，借助溶液法共沉淀氢氧化铝和谷氨酸，再将谷氨酸吸附到勃姆石上以制备有机-矿物微型复合体。上图绘制了溶液和沉淀物中C的分配，由此可以更好地确定谷氨酸在氢氧化铝以及勃姆石上的饱和吸附水平。

利用O-PTIR和ATR-FTIR技术对制得的有机-矿物微型复合体进行分析，可以发现O-PTIR的峰强显著高于ATR-FTIR，说明O-PTIR对有机-矿物微型复合体的检测灵敏度更高。1555cm⁻¹和1350cm⁻¹处的峰各自代表谷氨酸的COO−以及Al(OH)₃的O−H，基于两处的峰强之比可绘制得到右半图。

O-PTIR的Organic/inorganic ratio显著高于ATR-FTIR，这说明相较于矿物，O-PTIR对有机质的检测更为灵敏。本试验结果突出了O-PTIR在矿物基质中进行亚微米级定位和识别有机化合物（及其异质性）的能力。

此外，研究还使用了O-PTIR的高光谱分析技术，在微米尺度上分析谷氨酸与矿物的不同结合状态，首先在扫描区均匀取点，以不同颜色将所得的点分为5组(A)，将结果进行PCA分析(B)，得出在PC1上样品的可分析性更高，再基于此绘制5组点位的平均光谱结果图(C)，参考谷氨酸及矿物的标准参考谱图(D)，可以发现图C自上而下依次为结合程度不一的谷氨酸-矿物复合体，最上方有机质的占比最高，最下方有机质的占比最低。

这说明O-PTIR技术可以在微米尺度上区分谷氨酸与矿物的结合状态，进一步突出突出了O-PTIR在复杂环境介质中识别矿物相关有机质的潜力。

试验4

本研究的第4个试验进一步比较了O-PTIR与ATR-FTIR在样品检测方面的灵敏度，主要通过O-PTIR与ATR-FTIR的信号比进行定量判断。采用统一的辐照功率和光谱范围，再各自积分扫描区域的光谱信号总值，基于公式计算其信号比。

结果显示，与高结晶度矿物相比，O-PTIR对低结晶度矿物的检测灵敏度较低；与高分子量有机化合物相比，O-PTIR对低分子量有机化合物的检测灵敏度较高。

这两个趋势可能与每种化合物特有的热膨胀有关。对于低结晶度矿物（如水铁矿和非晶态铝），元素聚合时缺乏原子排列可能会减缓热量散失，导致其对热量的抵抗力较低；对于低分子量有机物，较小的体积使其更容易通过热膨胀散热；O-PTIR技术使用的可见光探针可以分辨颜色变化，更易检测浅色样品的信号，而高分子量化合物通常颜色更深，其信号检测更为困难。

因此在复杂样品的分析中，必须考虑到不同样品检测灵敏度的差异，避免低估低结晶度矿物含量或是高估低分子量有机质含量。

建议与展望

基于试验结论，本篇研究也给出了以下O-PTIR样品分析建议：

1. 损伤阈值评估：不同结晶度的矿物和不同分子量有机质的辐照损伤阈值差异较大，须相应使用不同功率的激光进行分析，同时优先检测损伤阈值较低的物质

2. 各向异性化合物：对于各向异性化合物，如叶状硅酸盐或亮氨酸，优先采用O-PTIR进行分析，晶体的不同取向将显著改变峰强度

3. 矿物-有机界面分析：O-PTIR在识别和定位矿物基质中的有机化合物方面具有突出效果，有机质的最低检出限可达0.4 wt %

4. 样品制备：在共传播模式下进行映射时样品表面须相对平滑，在反向传播模式下进行映射时样品需相对较薄(<1mm)；优先使用冷冻保存和低温切片技术，因为有机树脂可能会干扰样品信号；优选选择红外光透过率较高的的CaF₂窗口作为载体

解读：吴雨琪 中国科学院生态环境研究中心

指导：伍松林 研究员 中国科学院生态环境研究中心

原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.est.4c09258?sessionid=124488768